生物医药是国家七大战略新兴产业之一，而生物制药专业是国家新设立的与生物医药产业相对应的本科专业，生物反应器（发酵罐）是使生物反应得以实现的装置，生物反应器工程是与基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程等相提并论的现代生物工程之一，它是衡量一个国家生物工程水平的重要标志，近年来在全球制药行业得到广泛应用和迅猛发展。药用菌物在中国有悠久应用历史，对药用真菌的开发利用已从早期的使用子实体配伍入药发展到工业深层发酵，其中巨型生物发应器是工业深层发酵必需设备。目前世界上最大的发酵罐高度超过100 m，容量可达4000 m³。如今健康养生的观念已经深入人心，而作为“有病治病、无病养生”的灵芝的神奇保健功效理念已经被国人所接受。分析显示,目前我国以灵芝为主要原料的养生保健产品超过500个，以灵芝为原料的药品有100多个，灵芝产品的销售额已超过100亿元。传统的灵芝的人工栽培技术其过程耗时费力、产品质量不可控，因此采用先进的现代发酵工程技术生产灵芝成为主流。

然而，灵芝发酵生产相关的实验教学面临着种种问题：

第一，生物反应机理比较复杂，发酵罐的实际操作专业性强，存在过程不可逆、不可重复等缺点，教学过程中的一次失败往往会前功尽弃，长周期性的实验注定学生无法自主探索足够多的发酵方案；

第二，生产用发酵罐的原型结构几何尺度大，若实验模型采用过大的缩尺比例，则将影响实验数据的可信度与准确性，从而造成该实体实验占地面积大、空间要求高；

第三，灵芝发酵设备价格高、投料成本高、维护费用高，很少有院校会投入大量资金建设实验室，极大的限制了实体实验引入专业教学。

第四，发酵罐在操作过程中必然会用到高温（121℃以上）、高压（0.1 MPa以上）等极限条件，其积聚的大量能量容易造成超限操作发生的突然爆炸，后果十分严重，具有超强的危险性。

另外，灵芝发酵生产还会造成废水、废菌渣等的产生，下游处理困难，不可避免地对环境造成一定的污染。

针对上述问题，团队以相关科研和教学成果为基础，为《生物制药综合实验》课程自主研发了药用菌物灵芝发酵生产虚拟仿真实验。实验共占用三学时，分别教学以下三部分：发酵罐的认知、灵芝发酵、发酵终点判定。发酵罐的认知部分学生需了解发酵罐的各部分名称及用途、灵芝的药用价值和药理活性、灵芝的生长周期和分类等。灵芝发酵部分学生需要熟悉灵芝的具体发酵流程。其中部分关键参数设置需要学生选择，不同选项会对实验结果产生影响，从而达到强化学生对关键操作步骤的记忆。发酵终点的判定要求学生掌握灵芝发酵液菌丝体的提取和多糖含量的测定方法，通过多糖含量判定发酵终点。通过该虚拟仿真平台的模拟练习，学生应全面掌握灵芝发酵罐的实验背景和实验操作，掌握灵芝发酵大生产的过程，从而培养学生探究性的思维方式和解决复杂问题的综合能力。下图为虚拟仿真实验的主页面。

                                                                             图1虚拟仿真实验主页面

图 2 实验流程

进入系统

学生登录系统，出现欢迎界面，点击确定出现新手引导。

目的：学生可了解相关操作方法，方便后续步骤进行。

图3  欢迎界面

图4  新手引导界面

步骤二：药用菌物灵芝发酵生产虚拟仿真实验背景介绍

点击“实验简介”，可查看实验背景、实验目的及实验流程。

目的：旨在回顾《生物制药综合实验》相关理论及背景，了解实验目的，熟悉实验流程。

图5  实验简介界面

步骤三：发酵罐各部件的认知。

在实验开始前对大型发酵罐罐体部件进行学习，点击各个按钮查看各部件所在位置与功能。

目的：掌握发酵罐工作原理，领悟大型发酵罐的部件功能及所在为位置，并分析与实验室的小型发酵罐的异同。

图6  发酵罐认知界面

步骤四：灵芝种类和生长过程

对本实验的对象灵芝生长过程与品种进行学习，点击按钮观看灵芝生长过程与品种介绍。

目的：学生通过对灵芝生长过程、品种等知识的学习，掌握灵芝的药用价值，感受药资源可持续发展理念。

图7  灵芝认知界面

步骤五：预习考核。

点击右下角实验考核进行预习效果的考察。

目的：对上述学习情况进行考察，并深入了解药用菌物发酵原理及意义。

图8  预习考核界面

步骤六：空消。

原理：在投料前，空气管路、种子罐、发酵罐必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌、芽孢，保证系统处于无菌状态。

目的：通过空消压力的探索，让学生认识到生产安全的重要性。

效果：在实验开始前点击提示按钮设置蒸汽压力并开始空消，若输入值不在正常范围内则会出现提示。开始空消后出现空消细节及相应压力、温度变化曲线。

图9  空消压力探索界面

图10  空消过程界面

步骤七：麸皮添加量单因素考察。

设计麸皮单因素考察实验，填入5个想要考察的麸皮添加量。

原理：麸皮为培养基中维生素的重要来源，一般含量在1-6%之间。

目的：通过考察液体培养基中麸皮单因素对实验的影响，让学生掌握麸皮添加量与实验结果之间的关系，寻求最佳添加量。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后，可查看相关曲线图。

图11  麸皮单因素考察界面

步骤八：酵母膏添加量单因素考察。

设计酵母膏单因素考察实验，填入5个想要考察的酵母膏添加量。

原理：酵母膏为培养基中重要的氮源，一般含量在0.1-0.3%之间。

目的：通过考察液体培养基中麸皮单因素对实验的影响，让学生掌握酵母膏添加量与实验结果之间的关系，寻求最佳添加量。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后，可查看相关曲线图。

图12  酵母膏单因素考察界面

步骤九：糊精添加量单因素考察。

设计糊精单因素考察实验，填入5个想要考察的酵母膏添加量。

原理：糊精为培养基中重要的碳源，一般含量在1-3%之间。

目的：通过考察液体培养基中麸皮单因素对实验的影响，让学生掌握糊精添加量与实验结果之间的关系，寻求最佳添加量。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后，可查看相关曲线图。

图13 糊精单因素考察界面

步骤十：磷酸二氢钾添加量单因素考察。

设计磷酸二氢钾单因素考察实验，填入5个想要考察的酵母膏添加量。

原理：磷酸二氢钾为培养基中重要的无机盐来源，一般含量在0.1-0.3%之间。

目的：通过考察液体培养基中麸皮单因素对实验的影响，让学生掌握磷酸二氢钾添加量与实验结果之间的关系，寻求最佳添加量。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后，可查看相关曲线图。

图14  磷酸二氢钾单因素考察界面

步骤十一：培养基综合考察。

根据单因素考察结果，设计培养基综合考察实验。分别填入合适的培养基添加量。

原理：培养基是灵芝发酵的关键，灵芝是木腐性菌物应选择针对植物性菌物的培养基。充足且合理的碳源、氮源、维生素和无机盐配比可以让发酵生产事半功倍。

目的：以单因素考察为基础，进行培养基配方的综合考察。让学生对灵芝发酵的关键环节有更全面的理解，对发酵原理及参数之间的相互关系有更深刻的学习。

图15  培养基综合考察

步骤十二：添加消泡剂。

根据提示点击消泡剂添加阀，设置消泡剂添加量并开始实消。

原理：实消时要向培养液中加消泡剂，以避免发酵时泡沫过多，产生“溢罐”现象，引起投料损失。

目的：通过对消泡剂添加量的考察，让学生了解发酵产生泡沫的原因，意识到消泡的重要性，并掌握合适的消泡剂添加量。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后出现实消动画，动画结束后出现培养基综合考察结果（菌丝体生物量及多糖含量）。

图16  消泡剂考察界面

步骤十三：通气量考察。

在操作面板填写通气量。

原理：通气量对灵芝菌丝体的生长和胞内多糖合成有一定的影响。大生产以0.5~1.5：1为适宜通气量。

目的：通过对通气量的考察，使学生了解到发酵过程中需要通入空气的原因，熟悉通气量过大或过小的危害，掌握合适通气量范围。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后点击下一步进入下一个发酵罐参数设定。

图17  通气量考察界面

步骤十四：温度量考察。

在操作面板填写发酵温度。

原理：发酵过程中，温度是非常重要的技术参数，若不能控制到最佳温度，对发酵完成后的多糖含量以及菌丝体数量均有巨大的影响。26-30℃是最佳温度。

目的：通过对温度的考察，使学生了解发酵过程中温度控制的重要性，熟悉温度对发酵产物形成的影响，掌握合适温度范围。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后点击下一步进入下一个发酵罐参数设定。

图18  发酵温度考察界面

步骤十五：搅拌速度考察。

在操作面板填写搅拌速度。

原理：搅拌可以使发酵物分散均匀，使温度、氧气、pH分散均匀。偏小导致溶氧量少，导致菌丝生长周期延长；转速过快，菌丝体生长形态不佳。一般大生产以75-125 rpm为好。

目的：通过对搅拌速度的考察，使学生了解发酵过程中搅拌速度的重要性，熟悉搅拌对发酵液物质分散的影响，掌握合适搅拌速度范围。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后点击下一步进入下一个发酵罐参数设定。

图19  搅拌速度考察界面

步骤十六：发酵天数考察。

在操作面板填写发酵天数。

原理：足够的发酵天数可以使灵芝充分发酵，菌丝体数量增加，多糖含量增加。发酵天数过多，培养基营养不足，导致菌丝体和多糖含量下降；发酵天数过少，导致发酵不充分。一般大生产以发酵2-5天为好。

目的：通过对发酵天数的考察，使学生了解发酵过程中发酵天数与发酵终点的关系，掌握合适的发酵天数范围。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。输入完毕后点击下一步进入下一个发酵罐参数设定。

图20  发酵天数考察界面

步骤十七：发接种量考察。

在操作面板填写接种量。

原理：接种，按无菌操作技术要求将灵芝菌种移接到发酵罐培养基质中的过程。本步骤将灵芝菌种从种子罐直接用无菌蠕动泵转移至发酵罐中。一般在5%到20%左右（按培养基的体积计）。

目的：通过对接种量的考察，使学生了解发酵过程中接种量与发酵天数的关系，掌握合适的接种量范围。

效果：若输入值不在正常范围内则会出现提示。随后出现发酵过程、发酵结果及取样、出料、清洗按钮与动画。

图21  接种量考察界面

图22  发酵结束界面

图23  发酵参数考察结果界面

图24  出料界面

图25  清洗界面

步骤十八：灵芝发酵完整参数设置。

分别根据培养基配方与发酵罐参数考察结果，填写完整综合的参数设置，并得到最终菌丝体和多糖含量。

原理：培养基配比和发酵罐参数是灵芝发酵生产的两大重要环节，缺一不可，故本步骤可以让学生对上述学习内容进行总结分析归纳，得到最佳的完整的灵芝发酵过程参数设置。

效果：填写合适的参数，若输入值不在正常范围内则会出现提示。可以点击按键返回查看单因素考察结果。

图26  培养基与发酵参数综合考察结果界面

步骤十九：菌丝体显微观察。

出料后，在显微镜下观察菌丝体形态，点击各菌丝体种类，查看形态。

目的：通过对菌丝体形态的观察，掌握不同菌丝体形态的功能及名称。

效果：点击按钮，出现相应菌丝体形态，进行学习。

图27  显微观察界面

步骤二十：菌丝体生物量及多糖含量检测。

从简单原理出发，模拟实验室检验菌丝体生物量及多糖含量方法，对取样产物进行分析检测。

原理：离心、洗涤、烘干至恒重后称定菌丝体的生物量；水提醇沉法提取菌丝体中的多糖，并用硫酸苯酚法将多糖染色，用紫外-可见分光光度法检测多糖含量。

目的：通过对样品的检测分析，使学生了解检测原理，熟悉检测步骤。

图28  实验室分析检测界面

步骤二十一：提交实验报告。

回到主界面，提交实验报告。

图29  实验结束界面

图30  实验报告界面

本实验涉及培养基与发酵罐参数的各步骤结果与结论以菌丝体和多糖含量为指标，与所填参数相关。学生所填参数均要切合实际，若填入不切合实际的参数，系统将出现提示，告知学生正常范围。

图32  空消压力超出合理范围提示界面

图33  空消压力过低提示界面

图34  空消压力过高提示界面

在符合实际的参数范围内，多糖含量与菌丝体含量均呈现类抛物线样趋势，在理论最佳条件下达到最高产量，并向两边减少。其他步骤结果以完成度或与理论最大值差距来评判，若不在合理范围内也将出现提示，告知合理范围。

图35  麸皮单因素考察曲线图

图36  发酵温度超出合理范围提示界面

方案验证再次填写培养基配比与发酵的参数，此时填写数值应分别为之前考察的最优设置，若在合理范围内填写，则根据公式得出结果，若不在合理范围内，则出现相应提示。

图37  磷酸二氢钾超出合理范围提示界面

得到最终结果后，若菌丝体含量或者多糖含量过低，则可以重新设计方案，通过多次实验得到最佳方案，从而牢固学生对于灵芝发酵生产相关知识点的记忆。

图38  方案设计结果界面